【要　約】
　本研究は、良質な栄養素を含む脱脂粉乳を用いて、日本の伝統的発酵技術を利用して調製した機能性発酵調味料の効果的利用法を開発することを目的としている。さらに、発酵・醸造過程で生じるたんぱく質の分解産物であるペプチドなどによりもたらされる生体調節機能（血圧降下作用、抗酸化活性等）についても検討した。

　米麹（こうじ）を用いて脱脂粉乳を直接発酵させ、カルシウム含量が豊富で抗酸化活性と血圧降下作用を有する機能性調味料を開発した。この脱脂粉乳分解発酵調味料（以下、「発酵調味料」という。）には、乳成分であるカゼイン、β-ラクトグロブリン、α-ラクトアルブミンなどが経時的に分解し、低分子物質や遊離アミノ酸が増加することが認められた。このように発酵に伴い生じる低分子物質のペプチドや遊離アミノ酸が増加することで、まろやかさやうま味の増強効果が期待できる。また、抗酸化作用に関係したDPPHラジカル消去活性と血圧上昇抑制効果に関連するACE阻害活性の増加も認められた。

　次に、発酵調味料の効果的利用法を検討するため、原料赤肉の8%を発酵調味料で代替して製造したソーセージは、香辛料などを加えることにより、官能評価で高い評価を受けた。また、このソーセージは脱脂粉乳分解物に起因すると考えられる抗酸化能およびACE阻害活性を有しており、食品の付加価値が高まることが示唆された。

　さらに、発酵調味料を使用した、スキム鍋、グラタン、ドレッシング、ごまマヨネーズ、ぬか漬け風漬物、鶏の唐揚げ、味噌漬け風（魚）・（豚肉）、クッキーのレシピを開発し、料理について官能評価（5段階評価）を行った。官能評価の結果、すべての料理において「総合評価」の平均値が3を越えたことから、食味性の高い料理を作ることが出来たと考えられ、発酵調味料はさまざまな料理に使用できることが明らかとなった。

【キーワード】
　脱脂粉乳、発酵調味料、血圧降下作用、ACE阻害活性、抗酸化活性、生活習慣病予防、臓器障害予防、カルシウム、機能性食品

1．目的

　近年日本では、高齢化・長寿化が急速に進行しており、高齢者の健康対策の視点、特に老化進行の防止、高齢期疾病の予防の観点から、赤ワインや紅茶、ココアなど、食品の抗酸化性が注目されている^1）。現在、日本の死亡順位は、1位が悪性腫瘍（しゅよう）、2位が心疾患、3位が脳血管疾患であり、後者二疾患の代表的な疾患に心筋梗塞（こうそく）、脳梗塞がある。これらは、ともに基礎の病態に動脈硬化性病変を伴って発症し、生活習慣病と深い関わりがあり、この動脈硬化を引き起こす要因の一つに高血圧があるため、近年、さまざまな高血圧予防効果を持つ食品が開発されている^2）。

　当研究室でも機能性味噌（みそ）を開発した。この味噌は、良質な栄養素を含む脱脂粉乳を利用したもので、わが国で栄養所要量に不足しているとされるカルシウムも豊富に含み、醸造技術によりさらに乳由来の生理活性機能も付与したニュータイプの味噌である^3-9）。この味噌は、クリーミーな風味を有するとともに血圧上昇抑制活性も有していた。さらに、動物実験で確認したところ、骨粗鬆（しょう）症ラットで骨密度に改善が見られ、自然発症高血圧ラット（SHR）を用いた経口投与の実験でも顕著な血圧降下作用が確認された^4、5、9）。

　そこで、基礎試験や動物試験だけではなく、ヒトによる試験も必要との考えから、この「機能性ミルキー・味噌」のヒトによる試験を行った。その結果、3カ月間の摂取では、血圧の変化は認められなかったものの、ミルキー味噌摂取群において血中アンギオテンシン2レベルの有意な低下が認められた。アンギオテンシン2の減少はミルキー味噌がアンギオテンシン2産生の律速酵素であるACEの阻害活性を持つペプチドを含有することから、ミルキー味噌摂取による影響であると考えられた。

　ACE阻害剤は顕著な血圧降下をもたらさないレベルでも、心血管系や腎臓を含む主要臓器の臓器障害を減弱させ、動脈硬化や心不全の防止に効果があると考えられていることから、ミルキー味噌の摂取によりアンギオテンシン2濃度の低下が認められたことは、ミルキー味噌がこれらの疾患に対して予防効果を持っている可能性が示唆された^4、9）。また、ミルキー味噌によるアンギオテンシン2低下作用について、補強証拠を得ることができた^9）。

　しかし、ミルキー味噌に用いられている脱脂粉乳は、全体量に対して最大で2割程度であり、さらに多くの脱脂粉乳を利用することを考え、本研究では、製菓・製パンや耐熱性が必要な飲料などに適したハイヒートタイプの脱脂粉乳と麹菌を用いた新規乳製品の開発に関する研究とその有効利用に関する研究を実施した。

　こうして開発した発酵調味料は、機能性味噌と同様に高血圧予防効果や抗酸化活性などの機能性を有しているが、原料である脱脂粉乳や発酵に起因する独特の風味があり、万人に受け入れられるし好性では弱点がある。そこで、この発酵調味料の利用拡大を目指して、原料肉（赤身）の一部を発酵調味料で代替したソーセージを製造し、食味性と機能性について検討した。さらに、発酵調味料を使用したさまざまな料理のレシピ開発を行うとともに官能評価も実施した。

【解　説】

ヒトの血圧調節機構は複雑であるが、基本的には血圧を上昇させるレニンーアンギオテンシン系（昇圧系）と降下させるカリクレインーキニン系（降圧系）の相互バランスにより、血圧は一定に保たれている。この両方の血圧調節系に働きかける重要な酵素がアンギオテンシンI変換酵素（ACE）である。図に示した様に、ACEは、末梢血管の平滑筋を直接収縮させ、またレニンーアンギオテンシン系で血管運動中枢を介して強い血圧上昇作用を示す昇圧ペプチド（アンギオテンシンII）を生成する。このペプチドは各種生活習慣病の増悪因子でもある。したがって、ACEの加水分解反応を阻害することで血圧の上昇は妨げられることになる。

2．実験材料および方法

1）実験材料

　原材料の脱脂粉乳は、雪印乳業（株）製ハイヒートタイプの脱脂粉乳（SH）を利用した。

2）試料の調製

　脱脂粉乳と米麹菌（Aspergillus oryzea）を同量混合し、さらに雑菌の繁殖を抑えるため、全体量に対して食塩を4％、水分含量を48％と設定し、エタノールを5％加え調製した。恒温乾燥機を使用し、30℃で4、8、12週間発酵させた。

　なお、脱脂粉乳の効果的利用法検討のために使用した発酵調味料は、脱脂粉乳と米麹を同量混合し、全体量に対して食塩を4.8％、エタノールを5.1％添加し、35℃で12日間発酵したものを脱脂粉乳分解物とした。

3）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル　電気泳動（SDS-PAGE）

　SDS-PAGEは、Leammliの方法^10）で行った。アクリルアミド濃度7.5〜20.0％のグラジエントゲルを用いてスラブ型の泳動槽で行った。

4）ゲルろ過高速液体クロマトグラフィー（HPLC）

　分子量分布をHPLCにより分析した。分析は、TSKgel G2000SWXLカラム（7.8mm I.D.×30cm）を島津製LC-10AD型のHPLC装置に接続して行った。

5）遊離アミノ酸量の測定

　遊離アミノ酸の測定は、全自動アミノ酸分析機JLC-500/V（日本電子株式会社製）を用いて行った。

6）DPPH（1、1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）ラジカル消去活性の測定

　DPPHラジカル消去活性の測定は、DPPH分光測定法^11）に準じてSHIMAZU製Bio Spec-1600型分光光度計（吸光度520nm）を用いて測定した。サンプルの代わりに既知の抗酸化物質であるTroloxを使って測定し、サンプルのTrolox相当量を検量線から求めた。その消去活性は、μmole Trolox相当/gで示した。

7）アンギオテンシン1変換酵素（ACE）阻害活性の測定

　ACE阻害活性の測定は、Cushmanらの方法^12、13）に準じて、ウサギ肺由来ACE（シグマ社製）とHHL（ヒプリル-L-ヒスチジル-L-ロイシン、ナカライテスク社製）を用いて、SHIMAZU製Bio Spec-1600型分光光度計（吸光度228nm）にて測定した。阻害率は、試料の吸光度をS、試料の代わりに蒸留水を加えて同様に反応させた値をC、あらかじめACEの反応を停止させた時の値をBとして、次式により求めた。

　　阻害率（％）＝｛（C−S）/（C−B）｝×100

　上式より求められる阻害活性が50％を示すときの阻害物質濃度（反応液1ml当たりのタンパク質量、IC50）を計算した。

8）発酵調味料混合ソーセージの調製

　国産豚のモモ肉および背脂肪を用い定法によりソーセージを調製した。ソーセージの調製方法は以下の通りである。

　ミートグラインダー（National MK-GL20-W）に原料肉を入れ、赤身と脂肪をそれぞれ細切した。細切した原料肉と副原料を混合し、サイレントカッターにてエマルジョンを調製後、天然豚腸に充填した。4℃、24時間冷蔵保存後、78℃で30分間加熱した。3分間ボイルまたは3分間ベイクし、官能評価を実施した。

　表1に発酵調味料を混合して調製したソーセージの配合割合を示した。なお、試験区では予備実験で得られた結果から原料赤身肉の8％を発酵調味料で代替した。

表1　発酵調味料混合ソーセージの配合割合

9）ソーセージから機能性評価用試料の抽出

　発酵調味料、ソーセージをそれぞれ1g量とり、3mlの蒸留水、または4mlの80％エタノールを添加ししホモジナイズした。ホモジェネートを遠心分離（5000×g、10分間）した後、上清を回収した。ACE阻害活性の測定には蒸留水に溶かしたものを、DPPHラジカル消去活性の測定には、80％エタノールに溶かしたものを試料として用いた。

10）官能評価

　製造したソーセージの評価では、被験者にはソーセージに発酵調味料が含まれていることを伝えず、再度食べても良いと感じたものを選んで頂いた。色、におい、食べた時の硬さ、味、総合的な好ましさ、の5項目について5段階で評価した。19名（男性9名、女性10名）のパネラーによる官能評価を宮崎大学で実施した。

　発酵調味料の効果的利用法のために開発したレシピを基に料理を作り、官能評価を行った。官能評価は、おいしさ、風味、コク、食感、見た目・色、総合評価の6項目について5段階評価で行った。パネラーは9名（男性2名、女性7名）で、宮崎調理製菓専門学校にて行った。

3．結果および考察

1）調製した試料の外観

　発酵調味料を示す写真を図1に示した。この写真から分かるように、0週に比べ12週では白色から茶色もしくは黒色に変化した。経時的に脱脂粉乳の発酵が進行していることが認められた。

図1　試験品の経時を示す写真
（30℃で0、4、8、12週間発酵させた標品）

2）SDS-PAGEによる分子量分布解析

　新規調味料の発酵に伴う分子量分布の変化をSDS-PAGEで検討した結果を図2に示した。0週の試料をホモジネートしたものでは、分子量の大きい順に80、58、39、28、21.5、19、17、14.5、13、6.5kのバンドが確認でき、発酵期間が4週と8週になると、80、58、19、17kDaのバンドは薄くなりほとんど検出されなかった。39、28kDaのバンドは、0週に比べ、4週と8週では薄くなった。上清の0週では、分子量39、19、17、13、6.5kDaのバンドが確認でき、4、8週の試料では、39kDaのバンドは薄くなり、19、17、13kDaのバンドはほとんど見えなくなった。これらの結果、ホモジネートと上清ともに、カゼイン、β-ラクドグロブリン、α-ラクトアルブミンなど脱脂粉乳由来の乳成分が、麹菌による発酵に伴って低分子量化したことが確認できた。さらに、牛乳アレルゲンの一つであるβ-ラクドグロブリンが発酵に伴いバンドが薄くなっていることから、麹菌発酵により低アレルゲン食品の開発の可能性が示唆された。

図2　SDS-PAGEによる0、4、8週の試料の分子量分布

3）HPLCによる分子量分布解析

　発酵調味料の発酵に伴う分子量分布の変化を推測するため、HPLCで検討し、図3ではマーカーのパターンを、図4ではマーカーから求めた溶出時間と分子量の関係を、図5では試料の分析結果を示した。

図3　マーカーのHPLC結果

図4　マーカーから求めた溶出時間と分子量の関係

図5　HPLCによる0、4、8週の試料の分子量分布

　0週では、ピーク面積からわかるように、溶出時間約23分、分子量約3,300の物質が特に多く含まれており、次に溶出時間約24分、分子量約2,200の物質が多いことが分かった。0週の溶出時間が約11、19分のピークは、分子量がそれぞれ約224、16kDaであり、これらの比較的分子量の大きな物質は、4、8週ではピークがほとんど現われなかった。一方、溶出時間約23分、分子量約3,300の物質は経時的に顕著に増加しており、溶出時間が約27、30分の分子量約730、370の比較的分子量の小さな物質は、0週に比べ4週や8週で増加していた。

　これらの結果から、脱脂粉乳由来の高分子物質が麹菌による発酵に伴い分解されたため、0週に比べ4、8週では、高分子物質が減少すると同時に低分子物質が増加したことが明らかとなった。

4）遊離アミノ酸量

　発酵乳製品のたんぱく質に生じている変化を調べるため、遊離アミノ酸量を測定し、結果を図6に示した。この結果、発酵期間に伴い、多くの遊離アミノ酸が増加し、たんぱく質が麹菌の酵素により分解されることが明らかになった。また、必須アミノ酸であるスレオニン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、リジン、トリプトファンの経時的な増加も確認できた。0週ではすべてのアミノ酸量は少なく、それぞれのアミノ酸による変化はあまり見られなかったが、グルタミンとロイシンは、発酵により顕著に増加した。さらに、発酵により呈味成分であるグルタミン酸、グリシン、アラニン、チロシンなどの増加も確認できた。

図6　0、4、8、12週の試料の遊離アミノ酸量

5）DPPHラジカル消去活性による抗酸化活性

　試験品のDPPHラジカル消去活性の結果を図7に示した。0週、4週、8週、12週それぞれ、0.58、1.00、2.09、2.69μmol　Trolox相当量/gであった。この結果、抗酸化活性が高くなることがわかり、0週に比べ12週では約5倍高くなった。これは、脱脂粉乳が米麹菌によって分解され、抗酸化物質が増加したためであると考えられた。

図7　0、4、8、12週の試料のDPPHラジカル消去活性

6）ACE阻害活性

　発酵調味料のACE阻害活性を測定した結果、いずれの試料もたんぱく質濃度依存的に活性が上昇した。阻害率から求めたIC50を図8に示した。0週、4週、8週、12週それぞれ、0.53、0.35、0.26、0.26mg/mlであった。この結果、0、4、8、12週すべてACE阻害活性は高く、麹由来のものであると考えられた。さらに、発酵期間が長くなるにつれ活性が高くなり、麹菌の酵素による脱脂粉乳の分解によりACE阻害活性物質が増加したと考えられた。また今回の実験系では、IC50は8週で最大になることがわかった。当研究室との共同研究により開発した機能性味噌のIC50は0.34 mg/mlであり^12）、本研究の試料と比較すると、機能性味噌は、4週間発酵させたものと同等であり、8週もしくは12週発酵させたものは、機能性味噌よりも高いACE阻害活性を示すことが明らかになった。

図8　0、4、8、12週の試料のACE阻害活性

　以上の結果から、経時的に乳成分であるカゼイン、β-ラクトグロブリン、α-ラクトアルブミンなどが分解し、経時的に低分子物質や遊離アミノ酸が増加したことが確認できた。この乳成分の低分子化は麹菌の酵素によるものであると考えられた。また、発酵に伴いDPPHラジカル消去活性とACE阻害活性の増加が認められ、経時的に抗酸化物質やACE阻害物質が増加したためであると考えられた。今後、機能性ペプチドの単離・同定、新しい機能性の探索、新規乳製品の発酵に関する最適条件や製品化へ向けたし好性の向上を検討する必要がある。

7）ソーセージの官能評価

　香辛料無添加で、赤身肉の8％を発酵調味料で代替したソーセージでは過半数の方から再度食べても良いという評価を得た。しかし、3％、5％代替したものと比較すると、再度食べても良いと評価した方が減少しており、発酵調味料添加により食味性に影響が出ていると考えられた。被験者の中には、8％代替したソーセージは、脱脂粉乳分解物由来の独特の味、生臭さ、柔らかく食感が悪いことが問題と感じている方もいた。

　そこで、味、においを改善するため、バジル、オールスパイス、MSG（グルタミン酸ナトリウム）、砂糖、ニンニク、ショウガ、セイジとパセリを加え、コショウは風味の強い黒コショウに変更した。さらに、調理法によって、色、においを改善できないかと考え、78℃で30分間加熱した後、さらに3分間ボイルまたは3分間ベイクを追加して評価した。その結果、問題となっていた、色、臭い、共に平均値が3を超え、改善されることが明らかになった。「総合的な好ましさ」の評価値も3を越え、対照区と試験区で有意差がみられなかった。また、ボイルしたものとベイクしたものでは、色において1％水準で、硬さにおいて5％水準で有意差が認められた。従って、調理法による食味性の改善も有効であると考えられた。

8）ソーセージの機能性評価

（1）DPPHラジカル消去活性の測定
　ソーセージのDPPHラジカル消去活性の測定結果を図9に示した。対照区と比較すると、試験区の方が高い抗酸化能を有する傾向が認められた。この結果、脱脂粉乳分解物由来の抗酸化能がソーセージに付与されることが明らかになった。

図9　ソーセージ中の抗酸化能

（2）ACE阻害活性の測定
　ソーセージのACE阻害活性を測定し、阻害率から求めたIC50を図10に示した。対照区では活性が認められず、試験区のみACE阻害活性を有していた。よって、ソーセージの有していたACE阻害活性は発酵調味料に由来するものであると考えられた。

図10　ソーセージに残存するACE阻害活性

　以上のことから、官能評価では原料肉に対する代替率が8％以下であれば、ハーブなどを加えることにより高い評価を受けることが明らかとなった。また、製造したソーセージは発酵調味料に起因すると推測される抗酸化能およびACE阻害活性を有しており、発酵調味料を食品素材として使用することにより食品の付加価値が高まるとことが示唆された。

9）脱脂粉乳分解物を利用した料理のレシピの開発

　下記のような料理のレシピを開発した。

　料理；スキム鍋、グラタン、ドレッシング、ごまマヨネーズ、ぬか漬け風漬物、鶏の唐揚げ、味噌漬け風（魚）・（豚肉）、クッキー。

　上記料理の官能評価の結果、すべての料理において総合評価の平均が3を越えていることから、発酵調味料が食味性に悪影響を与えておらず、高い食味性を有した料理を作ることが出来たと考えられる。特に、スキム鍋、ごまマヨネーズ、クッキーの評価が高く、発酵調味料をうまく料理に取り込むことが出来たと考えられる。また、6カ月間室温で熟成した発酵調味料を用いて同様の料理を作ると、専門家による官能評価でさらに高い評価が得られた。

　本研究の結果から、脱脂粉乳を分解した発酵調味料はさまざまな料理に使用できることが示唆された。今後は、発酵調味料のさらなる利用拡大を目指して、まだ組み合わせたことのないジャンルの料理と組み合わせ、新しいレシピを開発していく必要があると考えられる。

　麹による脱脂粉乳分解物はin vitro、in vivoの実験で生活習慣病に対する生理活性機能を有する「新規調味料」となることも認められており、脱脂粉乳分解産物の日常の摂取が、各種病気や生活習慣病の予防に貢献し、ヒトの健康増進や医療費の節減効果が大いに期待できる^14−16）。

レシピ1【スキム鍋】
スキム鍋の材料および分量

＜作り方＞
（1）　鍋に出汁を入れて火にかけ、味噌、発酵調味料、酒を入れよく混ぜ合わせる。

（2）　そこに切った野菜と白身魚を入れ火が通った頃、豚肉をしゃぶしゃぶと入れる。

レシピ2【グラタン】
グラタンの材料および分量

＜作り方＞
（1）　マカロニをゆでる。

（2）　玉葱、鶏肉をバターで炒める。

（3）　火が通ったら小麦粉をふりかけ粉っぽさがなくなるまで炒める。

（4）　粉っぽさがなくなったら発酵調味料と牛乳を少しずつ加え、とろみがつくまで混ぜながら火を入れる。

（5）　ゆでたマカロニを（4）に加えて塩で味をととのえる。

（6）　グラタン皿に盛り、チーズ、パン粉をのせてオーブンでこんがりと焼く。

レシピ3【ドレッシング】
ドレッシングの材料および分量

＜作り方＞
（1）　ボールに調味料を全部入れ、泡立て器で泡が立たないようによく混ぜる。

（2）　野菜はよく洗い、レタスはちぎり、トマトはスライス、カリフラワーは適当な大きさにきって、固ゆでにする。

（3）　野菜にドレッシングをからませて器に盛る。　　

レシピ4【ごまマヨネーズ】
ごまマヨネーズの材料および分量

＜作り方＞
（1）　ボールに調味料を全部入れて良くかき混ぜる。

（2）　野菜は洗ってから、それぞれスティック状に切る。

（3）　スティック野菜の先にごまマヨネーズを付けて食べる。

レシピ5【ぬか漬け風漬物】
ぬか漬け風漬物の材料および分量

＜作り方＞
（1）　ぬか漬けの要領で、野菜を発酵調味料に漬け込む。

（2）　半日漬けたら取り出し、洗って切る。

レシピ6【鶏の唐揚げ】
鶏の唐揚げの材料および分量

＜作り方＞
（1）　合わせた調味料に鶏肉を漬け込む。

（2）　小麦粉をつけて油で揚げる。

レシピ7【味噌漬け風】
味噌漬け風の材料および分量

＜作り方＞
（1）　調味料を混ぜ合わせ二つに分ける。

（2）　一つに魚を、一つに豚肉を一晩漬け込む。

（3）　魚は魚焼きグリルで、豚肉はフライパンで焼く。

レシピ8【クッキー】
クッキー（プレーン）の材料および分量

クッキー（マーマレード）の材料および分量

＜作り方＞
（1）　バターに発酵調味料とグラニュー糖を加えてすり混ぜる。

（2）　そこに卵黄を入れて泡だて器でもったりとするまでよく混ぜる。

（3）　ふるった薄力粉を加えてヘラで混ぜる。

（4）　生地を2等分して片方にマーマレードを混ぜ込む。

（5）　棒状にまとめた生地をラップで包み、冷凍庫で冷やし固める。

（6）　8mmにカットして170度のオーブンで15分焼く。

【参考文献】
1．和田昭允、池原森男、矢野俊正：食品の抗酸化機能　−21世紀の食を考える−、ネスレ科学振興会：1、15（2002）
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3．六車　三治男：脱脂粉乳の新しい用途開発に成功−脱脂粉乳を利用したニュータイプの機能性みその開発−；畜産コンサルタント、No.476（8），57−63（2004）
4．六車　三治男、森　栄裕、河原　聡、丸山　眞杉、工藤　真豪、久寿米木　一裕、大谷　啓一、脇能　広、菱沼　毅、中村　豊郎：スキムミルクを利用したニュータイプ　の機能性みその動物実験について　日本畜産学会第104回大会講演要旨、P164（2005）
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